Uzado kaj antaŭzorgoj de ultrafiltra centrifuga tubo
1) Elektu taŭgan ultrafiltran tubon.Notu ke UF-membranoj malsamas en sia nivelo de toleremo al diversaj kemiaĵoj.Tipe, ultrafiltraj tuboj kun 10 kDa molekula pezo-tranĉo povas esti elektitaj kun molekula pezo-tranĉo, kiu ne devus esti pli granda ol 1/3 de la molekula pezo de la interesa proteino, kiel ekzemple 35 kDa.Se la molekulpezo de la interesa proteino estas proksimume 10 kd, ultrafiltradtubo kun molekulpeztranĉo de 3 KD povas esti uzita.
(2) La ultrafiltrado, ĵus aĉetita, estas seka, kun ultrapura akvo aldonita antaŭ uzo kaj akvo tute trapasita tra la membrano, glacia bano aŭ fridujo antaŭ malvarmetigita dum kelkaj minutoj.La akvo tiam estas elverŝita, t.e. la proteina likvaĵo, kaj kiom estas aldonita, kiom ajn estas ne pli ol la blanka linio ĉe la supro de la tubo.La operacio estas malpeza, kaj la ultrafiltra tubo devas esti antaŭmalvarmigita sur glacio antaŭ ol aldoni la proteinan solvon.
3) Kaj la maso kaj pezocentro devis atingi la ekvilibron.Notu, ke la rotacia rapideco kaj akcelo ne estas tre rapidaj, alie rekte damaĝante la ultrafiltran membranon.Centrifuga ultrafiltrado estis komencita (centrifugilo antaŭmalvarmigita al 4 gradoj).Post kiam la RPM de malsamaj centrifugiloj estis konvertita al g, ĝi estis malsama.La akcelo de la centrifugilo estis alĝustigita al minimumo, reduktante la premon sur la membrano.Notu, nepre forlasu la centrifugilon post kiam la centrifugilo atingis sian celrapidecon, aŭ se vi havas problemon, vi ne povas trakti ĝin por la unua fojo.La orientiĝo de la membrano al la spindelo estis ĝustigita laŭ la instrukcioj (angula centrifugilo estas membrano al akso perpendikulara).En praktika uzo, la ĝenerala rotacia rapideco estas pli malalta ol tiu en la instrukcioj, tiel ke la vivo de la centrifuga tubo povas esti plilongigita.
3) Kaj la maso kaj pezocentro devis atingi la ekvilibron.Notu, ke la rotacia rapideco kaj akcelo ne estas tre rapidaj, alie rekte damaĝante la ultrafiltran membranon.Centrifuga ultrafiltrado estis komencita (centrifugilo antaŭmalvarmigita al 4 gradoj).Post kiam la RPM de malsamaj centrifugiloj estis konvertita al g, ĝi estis malsama.La akcelo de la centrifugilo estis alĝustigita al minimumo, reduktante la premon sur la membrano.Notu, nepre forlasu la centrifugilon post kiam la centrifugilo atingis sian celrapidecon, aŭ se vi havas problemon, vi ne povas trakti ĝin por la unua fojo.La orientiĝo de la membrano al la spindelo estis ĝustigita laŭ la instrukcioj (angula centrifugilo estas membrano al akso perpendikulara).En praktika uzo, la ĝenerala rotacia rapideco estas pli malalta ol tiu en la instrukcioj, tiel ke la vivo de la centrifuga tubo povas esti plilongigita.
(4) Kiam koncentrite al la restanta 1 ml, prenu 50 ul da bufra solvaĵo, aldonu 10 ul da fluo tra kaj vidu ĉu estas blua koloro, kiel juĝo ĉu al la ultrafiltra tubo mankas proteino.Se la tubo estas lika, reverŝu la supran tavolon kaj trafluon en novan tubon por komenci ultrafiltradon.Por precize determini ĉu tuboj estis maltrafitaj, centrifugu dum 10 minutoj kun 5mgml da BSA antaŭ trafluo, kurante sur proteingluo, aŭ Bradford-kruda analizo, kaj daŭrigu aldonante la restantan koncentritan proteinsolvon (kiu funkcias sur glacio kaj malhelpas proteinojn de hejtado) ĝis ĉio el la koncentriĝo estis aldonita.Prizorgu dum centrifugado se okazas precipitaĵo de proteinoj, kondukante al tubo fermo.Se precipitaĵo okazas, determini ĉu la specifa kaŭzo de precipitaĵo estas troa proteinkoncentriĝo aŭ netaŭga bufro;La unua povas esti solvita per ultrafiltrado de multoblaj ultrafiltradtuboj samtempe, malpliigante la koncentriĝon, kaj ĉi-lastan interŝanĝante malsamajn bufrosolvojn ĝis neniu precipitaĵo de la proteino okazas.
(4) Kiam koncentrite al la restanta 1 ml, prenu 50 ul da bufra solvaĵo, aldonu 10 ul da fluo tra kaj vidu ĉu estas blua koloro, kiel juĝo ĉu al la ultrafiltra tubo mankas proteino.Se la tubo estas lika, reverŝu la supran tavolon kaj trafluon en novan tubon por komenci ultrafiltradon.Por precize determini ĉu tuboj estis maltrafitaj, centrifugu dum 10 minutoj kun 5mgml da BSA antaŭ trafluo, kurante sur proteingluo aŭ Bradford-kruda analizo, kaj daŭrigu aldonante la restantan koncentritan proteinsolvon (kiu funkcias sur glacio kaj malhelpas proteinojn de hejtado) ĝis ĉio el la koncentriĝo estis aldonita.Prizorgu dum centrifugado se okazas precipitaĵo de proteinoj, kondukante al tubo fermo.Se precipitaĵo okazas, determini ĉu la specifa kaŭzo de precipitaĵo estas troa proteinkoncentriĝo aŭ netaŭga bufro;La unua povas esti solvita per ultrafiltrado de multoblaj ultrafiltradtuboj samtempe, malpliigante la koncentriĝon, kaj ĉi-lastan interŝanĝante malsamajn bufrosolvojn ĝis neniu precipitaĵo de la proteino okazas.
(5) La unuaj paŝoj estas uzataj por koncentri la proteinon, kaj se la bufro devas esti ŝanĝita, milde aldonu novan bufron (ultrafiltrado tra 0.22um ultrafiltra membrano) al ĉirkaŭ 1ml da totala proteino, kaj rekoncentru al ĉirkaŭ 1ml por tri. sinsekvaj fojoj, kun la fina koncentrita fina volumo depende de la dezirata proteina koncentriĝo, ĝenerale ne pli ol 500ul, sed ankaŭ al ene de 200ul.Atingu 1000 × aŭ pli en tri okazoj, esence tiom da bufroŝanĝo, kiel kalkulite per almenaŭ 10 × aŭ pli da volumo riĉigo ĉiufoje.
(5) La unuaj paŝoj estas uzataj por koncentri la proteinon, kaj se la bufro devas esti ŝanĝita, milde aldonu novan bufron (ultrafiltrado tra 0.22um ultrafiltra membrano) al ĉirkaŭ 1ml da totala proteino, kaj rekoncentru al ĉirkaŭ 1ml por tri. sinsekvaj fojoj, kun la fina koncentrita fina volumo depende de la dezirata proteina koncentriĝo, ĝenerale ne pli ol 500ul, sed ankaŭ al ene de 200ul.Atingu 1000 × aŭ pli en tri okazoj, esence tiom da bufroŝanĝo, kiel kalkulite per almenaŭ 10 × aŭ pli da volumo riĉigo ĉiufoje.
Afiŝtempo: Nov-09-2022