PCR, estas la polimeraza ĉenreakcio, kiu rilatas al la aldono de dNTP, Mg2+, plilongigaj faktoroj kaj plifortigaj plibonigaj faktoroj al la sistemo sub la katalizo de DNA-polimerazo, uzante la gepatran DNA kiel ŝablonon kaj specifajn enkondukojn kiel deirpunkton de etendaĵo , Tra la ŝtupoj de denaturado, kalciado, etendaĵo, ktp., la procezo de en vitro reproduktanta filinfadenon DNA komplementan al la gepatra fadenŝablona DNA povas rapide kaj specife plifortigi ajnan celan DNA en vitro.
1. Varma Komenco PCR
La komenca tempo de plifortigo en konvencia PCR estas ne meti la PCR-maŝinon en la PCR-maŝinon, kaj tiam la programo komencas plifortiĝi.Kiam la sistema agordo estas finita, la plifortigo komenciĝas, kiu povas kaŭzi nespecifan plifortigon, kaj varma-komenca PCR povas solvi ĉi tiun problemon.
Kio estas varma starta PCR?Post kiam la reagsistemo estas preta, la enzimmodifilo estas liberigita ĉe alta temperaturo (kutime pli alta ol 90 °C) dum la komenca varmiga stadio de la reago aŭ "varma starto" stadio, tiel ke la DNA-polimerazo estas aktivigita.La preciza aktivigtempo kaj temperaturo dependas de la naturo de la DNA-polimerazo kaj la varm-komenca modifilo.Tiu metodo plejparte uzas modifilojn kiel ekzemple antikorpoj, afinecperantoj, aŭ kemiajn modifilojn por malhelpi la agadon de DNA-polimerazo.Ĉar la agado de DNA-polimerazo estas malhelpata ĉe ĉambra temperaturo, varma startteknologio disponigas grandan oportunon por prepari multoblajn PCR-reagsistemojn ĉe ĉambra temperaturo sen oferado de la specifeco de PCR-reagoj.
2. RT-PCR
RT-PCR (Inversa transskribo PCR) estas eksperimenta tekniko por inversa transskribo de mRNA en cDNA kaj utiligante ĝin kiel ŝablonon por plifortigo.La eksperimenta proceduro estas eltiri totalan RNA en histoj aŭ ĉeloj unue, uzi Oligo (dT) kiel enkondukon, uzi inversan transkriptazon por sintezi cDNA, kaj poste uzi cDNA kiel ŝablonon por PCR-amplifiĝo por akiri la celgenon aŭ detekti genekspresion.
3. Fluoreska kvanta PCR
Fluoreska kvanta PCR (Reala tempo Kvanta PCR,RT-qPCR) rilatas al la metodo de aldoni fluoreskajn grupojn al la PCR-reagsistemo, uzante la amasiĝon de fluoreskaj signaloj por monitori la tutan PCR-procezon en reala tempo, kaj finfine uzante la norman kurbon por kvante analizi la ŝablonon.Ofte uzitaj qPCR-metodoj inkludas SYBR Green I kaj TaqMan.
4. Nestita PCR
Nestita PCR rilatas al la uzo de du aroj de PCR-enkondukoj por du preterpasas de PCR-plifortigo, kaj la plifortiga produkto de la dua raŭndo estas la celgenfragmento.
Se miskongruo de la unua paro de enkondukoj (eksteraj enkondukoj) igas nespecifan produkton esti plifortigita, la ebleco de la sama nespecifa regiono esti rekonita per la dua paro de enkondukoj kaj daŭrante plifortigi estas tre malgranda, do la plifortigo de la dua paro de enkondukoj, la specifeco de PCR estis plibonigita.Unu avantaĝo de elfarado de du ĉirkaŭvojoj de PCR estas ke ĝi helpas plifortigi sufiĉan produkton de limigita komenca DNA.
5. Alteriĝo PCR
Touchdown PCR estas metodo por plibonigi la specifecon de PCR-reago alĝustigante la PCR-cikloparametrojn.
En alteriĝo PCR, la kalcia temperaturo por la unuaj malmultaj cikloj estas metita kelkajn gradojn super la maksimuma kalcia temperaturo (Tm) de la enkondukoj.Pli alta kalcia temperaturo povas efike redukti nespecifan plifortigon, sed samtempe pli alta kalcia temperaturo pligravigos la apartigon de enkondukoj kaj celsekvencoj, rezultigante reduktitan PCR-rendimenton.Tial, en la unuaj malmultaj cikloj, la kalcia temperaturo kutime malpliiĝas je 1 °C per ciklo por pliigi la enhavon de la celgeno en la sistemo.Kiam la kalcia temperaturo estas malaltigita al la optimuma temperaturo, la kalcia temperaturo estas konservita por la ceteraj cikloj.
6. Rekta PCR
Rekta PCR rilatas al la plifortigo de cela DNA rekte de la provaĵo sen la bezono de nukleaacida izoliteco kaj purigo.
Estas du specoj de rekta PCR:
rekta metodo: prenu malgrandan kvanton da specimeno kaj aldonu ĝin rekte al PCR Master Mix por PCR-identigo;
kraka metodo: post specimeno de la specimeno, aldonu ĝin al la lisato, lizigu por liberigi la genaron, prenu malgrandan kvanton da lizita supernatante kaj aldonu ĝin al PCR Master Mix, faru PCR-identigon.Ĉi tiu aliro simpligas la eksperimentan laborfluon, reduktas praktikan tempon kaj evitas DNA-perdon dum purigaj paŝoj.
7. SOE PCR
Gena splisado per interkovra etendaĵo PCR (SOE PCR) uzas enkondukojn kun komplementaj finoj por igi PCR-produktojn formi imbrikitajn ĉenojn, tiel ke en la posta plifortiga reago, tra la etendaĵo de la imbrikitaj ĉenoj, malsamaj fontoj de A tekniko en kiu plifortigitaj fragmentoj estas interkovritaj. kaj splisitaj kune.Ĉi tiu teknologio nuntempe havas du ĉefajn aplikdirektojn: konstruado de fuziogenoj;gena ejo-direktita mutacio.
8. IPCR
Inversa PCR (IPCR) uzas inversajn komplementajn enkondukojn por plifortigi DNA-fragmentojn krom la du enkondukoj, kaj plifortigas nekonatajn sekvencojn sur same flankoj de konata DNA-fragmento.
IPCR estis origine dizajnita por determini la sekvencon de apudaj nekonataj regionoj, kaj kutimas plejparte studi genajn reklamadsekvencojn;onkogenaj kromosomaj rearanĝoj, kiel gena fuzio, translokado kaj transponado;kaj virusgena integriĝo, ankaŭ estas ofte uzataj nun Por ejodirektita mutagenezo, kopiu plasmidon kun la dezirata mutacio.
9. dPCR
Cifereca PCR (dPCR) estas tekniko por la absoluta kvantigo de nukleaj acidaj molekuloj.
Ekzistas nuntempe tri metodoj por la kvantigo de nukleaj acidaj molekuloj.Fotometrio estas bazita sur la absorbado de nukleaj acidaj molekuloj;realtempa fluoreska kvanta PCR (Real Time PCR) estas bazita sur la Ct-valoro, kaj la Ct-valoro rilatas al la ciklonombro responda al la fluoreska valoro kiu povas esti detektita;cifereca PCR estas la plej nova Kvanta teknologio bazita sur unu-molekula PCR-metodo por kalkulado de nuklea acida kvantigo estas absoluta kvanta metodo.
Afiŝtempo: Jun-13-2023